一、亮發(fā)光桿菌菌種保藏的目的

微生物在使用和傳代過程中容易發(fā)生污染、變異甚至死亡,因而常常造成菌種的衰退,并有可能使優(yōu)良菌種丟失。菌種保藏的重要意義就在于盡可能保持其原有性狀和活力的穩(wěn)定,確保菌種不死亡、不變異、不被污染,以達到便于研究、交換和使用等諸方面的需要。

二、菌種保藏的原理

亮發(fā)光桿菌無論采用何種保藏方法,首先應(yīng)該挑選典型菌種的優(yōu)良純種來進行保藏,保藏它們的休眠體,如分生孢子、芽孢等.其次,應(yīng)根據(jù)微生物生理、生化特點,人為地創(chuàng)造環(huán)境條件,使微生物長期處于代謝不活潑、生長繁殖受抑制的休眠狀態(tài).這些人工造成的環(huán)境主要是干燥、低溫和缺氧,另外,避光、缺乏營養(yǎng)、添加保護劑或酸度中和劑也能有效提高保藏效果。

三、菌種保藏的方法

液氮超低溫保藏法簡稱液氮保藏法或液氮法.它是以甘油、二甲基亞砜等作為保護劑,在液氮超低溫（-196℃）下保藏的方法.其主要原理是菌種細胞從常溫過渡到低溫,并在降到低溫之前,使細胞內(nèi)的自由水通過細胞膜外滲出來,以免膜內(nèi)因自由水凝結(jié)成冰晶而使細胞損傷.美國ATCC菌種保藏中心采用該法時,把菌懸液或帶菌絲的瓊脂塊經(jīng)控制致冷速度,以每分鐘下降1℃/min 的速度從0℃直降到-35℃,然后保藏在-150℃～-196℃液氮冷箱中.如果降溫速度過快,由于細胞內(nèi)自由水來不及滲出胞外,形成冰晶就會損傷細胞.據(jù)研究認為降溫的速度控制在(1～10)℃/min,細胞死亡率低；隨著速度加快,死亡率則相應(yīng)提高。

液氮低溫保藏的保護劑,一般是選擇甘油、二甲基亞砜、糊精、血清蛋白、聚乙烯氮戊環(huán)、吐溫80等,但zui常用的是甘油（10%～20%）.不同微生物要選擇不同的保護劑,再通過試驗加以確定保護劑的濃度,原則上是控制在不足以造成微生物致死的濃度。

此法操作簡便、、保藏期一般可達到15年以上,是目前被*的zui有效的亮發(fā)光桿菌長期保藏技術(shù)之一.除了少數(shù)對低溫損傷敏感的微生物外,該法適用于各種微生物菌種的保藏,甚至連藻類、原生動物、支原體等都能用此法獲得有效的保藏.此法的另一大優(yōu)點是可使用各種培養(yǎng)形式的微生物進行保藏,無論是孢子或菌體、液體培養(yǎng)物或固體培養(yǎng)物均可采用該保藏法.其缺點是需購置超低溫液氮設(shè)備,且液氮消耗較多,操作費用較高。

要使用菌種時,從液氮罐中取出安瓿瓶,并迅速放到35～40℃溫水中,使之冰凍熔化,以無菌操作打開安瓿瓶,移接到保藏前使用的同一種培養(yǎng)基斜面上進行培養(yǎng).從液氮罐中取出安瓿瓶時速度要快,一般不超過1min,以防其他安瓿瓶升溫而影響保藏質(zhì)量.并且取樣時一定要戴手套以防止意外爆炸和凍傷。